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      標題摘要內容
       circRNA服務

      circRNA服務?
      circRNA CRISPR/CasRx敲低驗證
      來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2020-11-10 | 6614 次瀏覽 | 分享到:
      CRISPR/Cas13是繼CRISPR/Cas9之后新發現的一類核酸酶系統,與Cas9靶向DNA不同,Cas13可以特異靶向RNA,實現對RNA的敲低、定點編輯、剪切調控和檢測清除等?,F已發現LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、EsCas13d、AdmCas13d、CasRx(RfxCas13d)等多個Cas13核酸酶,都可以靶向切割RNA,其中CasRx(RfxCas13d)具有最高的特異性和切割效率,也是目前發現最小的VI型CRISPR效應蛋白,能更容易利用AAV載體實現體內遞送。

      圖1  CRISPR/CasRx系統敲低RNA示意圖
      CasRx靶向切割RNA時,靶標RNA的兩端無需PFS,因此gRNA的設計更靈活,基本可靶向RNA的任意位置。與shRNA/CRISPRi等基因沉默技術相比,CRISPR/CasRx顯示有更高的靶向特異性和敲低效率,以及最低的脫靶效應,表明其作為基因敲低工具的獨特優勢。

      CasRx與核定位信號NLS融合表達時主要定位于細胞核,能更高效敲低mRNA及在細胞核內的其他RNA。


      圖2  CasRx (HA)的亞細胞定位(Konermann et al., 2018)


      將gRNA設計為靶向環形RNA(circRNA)的反向剪切位點(back-splicing junction, BSJ)處時,CasRx能高效區分circRNA和其親本基因mRNA,特異靶向敲低circRNA,而不影響mRNA。相比于siRNA/shRNA敲低circRNA時容易出現的效率低、脫靶或錯誤靶向mRNA,使用CRISPR/CasRx系統敲低circRNA是一個強有力的選擇和補充工具。

      圖3  gRNA設計位置與circRNA/mRNA豐度(Li et al., 2020)。gRNA設計靶
      向BSJ時,circRNA(紅色)的豐度最低,而mRNA(藍色)的豐度基本不變。


      吉賽生物現提供四種整合型的載體,將CasRx和crRNA在同一個載體中表達,只需要設計合成gRNA序列并連接插入即可,載體構建和轉染方便。

      表1 四種載體區別及對應試劑盒貨號

      貨號

      載體名稱

      載體骨架

      U6-gRNA

      CMV-CasRx

      NLS

      GFP

      C0101-RL

      pCasRx-L1

      慢病毒載體

      有,NC

      C0101-RNL

      pCasRxN-L1

      慢病毒載體

      有,NC

      C0101-RA

      pCasRx-A1

      AAV載體

      有,NC

      C0101-RNA

      pCasRxN-A1

      AAV載體

      有,NC

      注:整合型載體為通用NC載體,含有non-targeting gRNA: TCACCAGAAGCGTACCATACTC。


      產品特點:
      • 全新敲低技術,為實現circRNA敲低提供新選擇。
      • 可定位于細胞核內,敲低效率更高。
      • 單一整合型載體同時表達CasRx和crRNA,載體構建和轉染方便。

      參考文獻:

      1. Konermann S, Lotfy P, Brideau NJ et al.. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell. 2018 Apr 19;173(3):665-676.e14. doi: 10.1016/j.cell.2018.02.033.
      2. Li SQ, Li X, Xue W et al.. Screening for functional circular RNAs using the CRISPR-Cas13 system. bioRxiv 2020, DOI: 10.1101/2020.03.23.002865. 
      3. Wessels HH, Méndez-Mancilla A, Guo X et al.. Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design. Nat Biotechnol. 2020 Jun;38(6):722-727. doi: 10.1038/s41587-020-0456-9.
      4. Haibo Zhou, Jinlin Su, Xinde Hu et al.. Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice. Cell. 2020 Apr 30;181(3):590-603.e16. doi: 10.1016/j.cell.2020.03.024. Epub 2020 Apr 8.
      5. Changyang Zhou, Xinde Hu, Cheng Tang et al.. CasRx-mediated RNA targeting prevents choroidal neovascularization in a mouse model of age-related macular degeneration. National Science Review, Volume 7, Issue 5, May 2020, Pages 835–837, https://doi.org/10.1093/nsr/nwaa033.
      6. Bingbing He, Wenbo Peng, Jia Huang et al.. Modulation of metabolic functions through Cas13d-mediated gene knockdown in liver. Protein Cell. 2020 Jul;11(7):518-524. doi: 10.1007/s13238-020-00700-2.

      附件:
      seq-pCasRx-A1-pCasRxN-A1
      seq-pCasRx-L1-pCasRxN-L1

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