CRISPR/Cas13是繼CRISPR/Cas9之后新發現的一類核酸酶系統,與Cas9靶向DNA不同,Cas13可以特異靶向RNA,實現對RNA的敲低、定點編輯、剪切調控和檢測清除等?,F已發現LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、EsCas13d、AdmCas13d、CasRx(RfxCas13d)等多個Cas13核酸酶,都可以靶向切割RNA,其中CasRx(RfxCas13d)具有最高的特異性和切割效率,也是目前發現最小的VI型CRISPR效應蛋白,能更容易利用AAV載體實現體內遞送。
圖1 CRISPR/CasRx系統敲低RNA示意圖
CasRx靶向切割RNA時,靶標RNA的兩端無需PFS,因此gRNA的設計更靈活,基本可靶向RNA的任意位置。與shRNA/CRISPRi等基因沉默技術相比,CRISPR/CasRx顯示有更高的靶向特異性和敲低效率,以及最低的脫靶效應,表明其作為基因敲低工具的獨特優勢。
CasRx與核定位信號NLS融合表達時主要定位于細胞核,能更高效敲低mRNA及在細胞核內的其他RNA。
圖2 CasRx (HA)的亞細胞定位(Konermann et al., 2018)
將gRNA設計為靶向環形RNA(circRNA)的反向剪切位點(back-splicing junction, BSJ)處時,CasRx能高效區分circRNA和其親本基因mRNA,特異靶向敲低circRNA,而不影響mRNA。相比于siRNA/shRNA敲低circRNA時容易出現的效率低、脫靶或錯誤靶向mRNA,使用CRISPR/CasRx系統敲低circRNA是一個強有力的選擇和補充工具。
圖3 gRNA設計位置與circRNA/mRNA豐度(Li et al., 2020)。gRNA設計靶
向BSJ時,circRNA(紅色)的豐度最低,而mRNA(藍色)的豐度基本不變。
吉賽生物現提供四種整合型的載體,將CasRx和crRNA在同一個載體中表達,只需要設計合成gRNA序列并連接插入即可,載體構建和轉染方便。
表1 四種載體區別及對應試劑盒貨號
貨號
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載體名稱
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載體骨架
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U6-gRNA
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CMV-CasRx
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NLS
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GFP
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C0101-RL
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pCasRx-L1
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慢病毒載體
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有,NC
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有
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無
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有
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C0101-RNL
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pCasRxN-L1
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慢病毒載體
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有,NC
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有
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有
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有
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C0101-RA
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pCasRx-A1
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AAV載體
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有,NC
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有
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無
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無
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C0101-RNA
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pCasRxN-A1
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AAV載體
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有,NC
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有
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有
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無
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注:整合型載體為通用NC載體,含有non-targeting gRNA: TCACCAGAAGCGTACCATACTC。
產品特點:
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全新敲低技術,為實現circRNA敲低提供新選擇。
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可定位于細胞核內,敲低效率更高。
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單一整合型載體同時表達CasRx和crRNA,載體構建和轉染方便。