標題摘要內容
circRNA服務
circRNA服務?
circRNA CRISPR/CasRx敲低驗證
來源:
|
作者:geneseed
|
發布時間: 2020-11-10
|
6614 次瀏覽
|
分享到:
CRISPR/Cas13是繼CRISPR/Cas9之后新發現的一類核酸酶系統，與Cas9靶向DNA不同，Cas13可以特異靶向RNA，實現對RNA的敲低、定點編輯、剪切調控和檢測清除等?，F已發現LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、EsCas13d、AdmCas13d、CasRx（RfxCas13d）等多個Cas13核酸酶，都可以靶向切割RNA，其中CasRx（RfxCas13d）具有最高的特異性和切割效率，也是目前發現最小的VI型CRISPR效應蛋白，能更容易利用AAV載體實現體內遞送。
CasRx與核定位信號NLS融合表達時主要定位于細胞核，能更高效敲低mRNA及在細胞核內的其他RNA。
將gRNA設計為靶向環形RNA（circRNA）的反向剪切位點（back-splicing junction, BSJ）處時，CasRx能高效區分circRNA和其親本基因mRNA，特異靶向敲低circRNA，而不影響mRNA。相比于siRNA/shRNA敲低circRNA時容易出現的效率低、脫靶或錯誤靶向mRNA，使用CRISPR/CasRx系統敲低circRNA是一個強有力的選擇和補充工具。
吉賽生物現提供四種整合型的載體，將CasRx和crRNA在同一個載體中表達，只需要設計合成gRNA序列并連接插入即可，載體構建和轉染方便。
產品特點：
圖1 CRISPR/CasRx系統敲低RNA示意圖
CasRx靶向切割RNA時，靶標RNA的兩端無需PFS，因此gRNA的設計更靈活，基本可靶向RNA的任意位置。與shRNA/CRISPRi等基因沉默技術相比，CRISPR/CasRx顯示有更高的靶向特異性和敲低效率，以及最低的脫靶效應，表明其作為基因敲低工具的獨特優勢。CasRx與核定位信號NLS融合表達時主要定位于細胞核，能更高效敲低mRNA及在細胞核內的其他RNA。
圖2 CasRx (HA)的亞細胞定位（Konermann et al., 2018）
將gRNA設計為靶向環形RNA（circRNA）的反向剪切位點（back-splicing junction, BSJ）處時，CasRx能高效區分circRNA和其親本基因mRNA，特異靶向敲低circRNA，而不影響mRNA。相比于siRNA/shRNA敲低circRNA時容易出現的效率低、脫靶或錯誤靶向mRNA，使用CRISPR/CasRx系統敲低circRNA是一個強有力的選擇和補充工具。
圖3 gRNA設計位置與circRNA/mRNA豐度（Li et al., 2020）。gRNA設計靶
向BSJ時，circRNA（紅色）的豐度最低，而mRNA（藍色）的豐度基本不變。
向BSJ時，circRNA（紅色）的豐度最低，而mRNA（藍色）的豐度基本不變。
吉賽生物現提供四種整合型的載體，將CasRx和crRNA在同一個載體中表達，只需要設計合成gRNA序列并連接插入即可，載體構建和轉染方便。
表1 四種載體區別及對應試劑盒貨號
注：整合型載體為通用NC載體，含有non-targeting gRNA: TCACCAGAAGCGTACCATACTC。
|
貨號 |
載體名稱 |
載體骨架 |
U6-gRNA |
CMV-CasRx |
NLS |
GFP |
|
C0101-RL |
pCasRx-L1 |
慢病毒載體 |
有，NC |
有 | 無 | 有 |
|
C0101-RNL |
pCasRxN-L1 |
慢病毒載體 |
有，NC |
有 | 有 | 有 |
|
C0101-RA |
pCasRx-A1 |
AAV載體 |
有，NC |
有 | 無 | 無 |
|
C0101-RNA |
pCasRxN-A1 |
AAV載體 |
有，NC |
有 | 有 | 無 |
產品特點：
- 全新敲低技術，為實現circRNA敲低提供新選擇。
- 可定位于細胞核內，敲低效率更高。
- 單一整合型載體同時表達CasRx和crRNA，載體構建和轉染方便。
參考文獻：
1. Konermann S, Lotfy P, Brideau NJ et al.. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell. 2018 Apr 19;173(3):665-676.e14. doi: 10.1016/j.cell.2018.02.033.
2. Li SQ, Li X, Xue W et al.. Screening for functional circular RNAs using the CRISPR-Cas13 system. bioRxiv 2020, DOI: 10.1101/2020.03.23.002865.
3. Wessels HH, Méndez-Mancilla A, Guo X et al.. Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design. Nat Biotechnol. 2020 Jun;38(6):722-727. doi: 10.1038/s41587-020-0456-9.
4. Haibo Zhou, Jinlin Su, Xinde Hu et al.. Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice. Cell. 2020 Apr 30;181(3):590-603.e16. doi: 10.1016/j.cell.2020.03.024. Epub 2020 Apr 8.
5. Changyang Zhou, Xinde Hu, Cheng Tang et al.. CasRx-mediated RNA targeting prevents choroidal neovascularization in a mouse model of age-related macular degeneration. National Science Review, Volume 7, Issue 5, May 2020, Pages 835–837, https://doi.org/10.1093/nsr/nwaa033.
6. Bingbing He, Wenbo Peng, Jia Huang et al.. Modulation of metabolic functions through Cas13d-mediated gene knockdown in liver. Protein Cell. 2020 Jul;11(7):518-524. doi: 10.1007/s13238-020-00700-2.
附件：
seq-pCasRx-A1-pCasRxN-A1
seq-pCasRx-L1-pCasRxN-L1