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      標題摘要內容
       自主產品

      自主產品?
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      T7轉錄試劑盒 | GS? T7 Biotin Labeled RNA Synthesis Kit
      來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2021-09-18 | 1988 次瀏覽 | 分享到:

      產品簡介

      本試劑盒利用重組T7 RNA聚合酶,以Biotin-NTP Mix為底物,在體外快速高效合成含生物素標記的RNA。合成的生物素標記RNA可用于RNA Pull-down、Northern Blot、原位雜交等實驗。使用1 μg DNA模板時,每次反應中RNA生成量不低于50 μg。


      產品組分

      組分

      R0402 (3 rxns) *

      T7 RNA Polymerase Mix

      4.75 μL

      T7 Reaction Buffer

      4.75 μL

      Biotin-NTP Mix **

      20 μL

      RNase-Free DNase I (1 U/μL)

      6.3 μL

      10× DNase Reaction Buffer

      30 μL

      RNase-Free Water

      300 μL

      *:使用20 μL體系時,本試劑盒可進行3次轉錄反應。

      **:Biotin-NTP Mix內含ATP, GTP, CTP, UTP和Biotin-16-UTP,其中UTP與Biotin-16-UTP的比例為2:1。


      保存條件

      低溫運輸,-20℃保存,保質期12個月。


      自備材料

      1. RNA純化回收:TRIzol LS Reagent、磁珠或過柱純化試劑盒。

      2. RNA檢測:微量分光光度計、Qubit熒光計、瓊脂糖凝膠電泳設備或Agilent 2100等。

      3. 其他試劑與耗材:RNase-Free或DEPC處理的PCR管和吸頭等。


      操作流程

      1.  DNA模板制備

      使用含有T7啟動子序列的線性化質粒、PCR產物或合成的寡核苷酸為模板,模板應保證高純度高質量,避免RNase、蛋白質、RNA或鹽類污染。

      以線性化質粒為模板的,應使質粒線性化形成平末端或5’突出末端,線性化后應進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,確保線性化切割完全,并純化回收。在20 μL反應體系中,線性化質粒模板可使用0.5~1 μg。

      以PCR產物為模板的,可在引物上加入T7啟動子序列進行PCR擴增,確保T7啟動子序列的方向正確。PCR產物應進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,確保條帶單一且大小正確,并純化回收。在20 μL反應體系中,PCR產物模板可使用0.2~0.75 μg。


      2. RNA轉錄合成

      1) 從試劑盒中取出各組分試劑,冰上融化顛倒混勻,短暫離心后置于冰盒上備用。

      2) 按照下表依次添加試劑,配置反應體系。

      表1  RNA轉錄合成的反應體系

      組分

      用量

      RNase-Free Water

      Up to 20 μL

      T7 Reaction Buffer

      1.5 μL

      Biotin-NTP Mix

      6.5 μL

      DNA模板

      X μL

      (線性化質粒0.5~1 μg,PCR產物0.2~0.75 μg)

      T7 RNA Polymerase Mix

      1.5 μL

      3) 顛倒混勻并短暫離心,置于PCR儀上37℃孵育2 h。合成小于300 nt的短鏈RNA時應37℃孵育4~16 h。


      3. DNA模板去除

      向反應液中依次添加68 μL RNase-Free Water,10 μL 10× DNase Reaction Buffer,和2 μL RNase-Free DNase I (1 U/μL),置于PCR儀上37℃孵育15 min。

            

            4.純化回收

        使用TRIzol LS Reagent、磁珠或RNA柱純化試劑盒,純化回收生物素標記的RNA。

            

             5.RNA檢測

      1) 定量檢測

      使用微量分光光度計(如Nanodrop)或Qubit熒光計檢測RNA的濃度和純度。


      2) 電泳檢測

      使用瓊脂糖凝膠電泳或Agilent 2100檢測RNA的大小和完整性,生物素標記的RNA分子量增大,條帶大小可能比預期偏大。使用非變性瓊脂糖凝膠電泳時,可以先將RNA置于65℃孵育10 min,再上樣檢測。



      產品說明書


      吉賽生物T7轉錄試劑盒說明書.pdf


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