產品簡介
本試劑盒利用重組T7 RNA聚合酶，以Biotin-NTP Mix為底物，在體外快速高效合成含生物素標記的RNA。合成的生物素標記RNA可用于RNA Pull-down、Northern Blot、原位雜交等實驗。使用1 μg DNA模板時，每次反應中RNA生成量不低于50 μg。
產品組分
組分 | R0402 (3 rxns) * |
T7 RNA Polymerase Mix | 4.75 μL |
T7 Reaction Buffer | 4.75 μL |
Biotin-NTP Mix ** | 20 μL |
RNase-Free DNase I (1 U/μL) | 6.3 μL |
10× DNase Reaction Buffer | 30 μL |
RNase-Free Water | 300 μL |
*：使用20 μL體系時，本試劑盒可進行3次轉錄反應。
**：Biotin-NTP Mix內含ATP, GTP, CTP, UTP和Biotin-16-UTP，其中UTP與Biotin-16-UTP的比例為2:1。
保存條件
低溫運輸，-20℃保存，保質期12個月。
自備材料
1. RNA純化回收：TRIzol LS Reagent、磁珠或過柱純化試劑盒。
2. RNA檢測：微量分光光度計、Qubit熒光計、瓊脂糖凝膠電泳設備或Agilent 2100等。
3. 其他試劑與耗材：RNase-Free或DEPC處理的PCR管和吸頭等。
操作流程
DNA模板制備
使用含有T7啟動子序列的線性化質粒、PCR產物或合成的寡核苷酸為模板，模板應保證高純度高質量，避免RNase、蛋白質、RNA或鹽類污染。
以線性化質粒為模板的，應使質粒線性化形成平末端或5’突出末端，線性化后應進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，確保線性化切割完全，并純化回收。在20 μL反應體系中，線性化質粒模板可使用0.5~1 μg。
以PCR產物為模板的，可在引物上加入T7啟動子序列進行PCR擴增，確保T7啟動子序列的方向正確。PCR產物應進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，確保條帶單一且大小正確，并純化回收。在20 μL反應體系中，PCR產物模板可使用0.2~0.75 μg。
2. RNA轉錄合成
1) 從試劑盒中取出各組分試劑，冰上融化顛倒混勻，短暫離心后置于冰盒上備用。
2) 按照下表依次添加試劑，配置反應體系。
表1 RNA轉錄合成的反應體系
組分 | 用量 |
RNase-Free Water | Up to 20 μL |
T7 Reaction Buffer | 1.5 μL |
Biotin-NTP Mix | 6.5 μL |
DNA模板 | X μL (線性化質粒0.5~1 μg，PCR產物0.2~0.75 μg) |
T7 RNA Polymerase Mix | 1.5 μL |
3) 顛倒混勻并短暫離心，置于PCR儀上37℃孵育2 h。合成小于300 nt的短鏈RNA時應37℃孵育4~16 h。
3. DNA模板去除
向反應液中依次添加68 μL RNase-Free Water，10 μL 10× DNase Reaction Buffer，和2 μL RNase-Free DNase I (1 U/μL)，置于PCR儀上37℃孵育15 min。
4．純化回收
使用TRIzol LS Reagent、磁珠或RNA柱純化試劑盒，純化回收生物素標記的RNA。
5．RNA檢測
1) 定量檢測
使用微量分光光度計（如Nanodrop）或Qubit熒光計檢測RNA的濃度和純度。
2) 電泳檢測
使用瓊脂糖凝膠電泳或Agilent 2100檢測RNA的大小和完整性，生物素標記的RNA分子量增大，條帶大小可能比預期偏大。使用非變性瓊脂糖凝膠電泳時，可以先將RNA置于65℃孵育10 min，再上樣檢測。
產品說明書