產品簡介
本試劑盒利用重組T7 RNA聚合酶,以Biotin-NTP Mix為底物,在體外快速高效合成含生物素標記的RNA。合成的生物素標記RNA可用于RNA Pull-down、Northern Blot、原位雜交等實驗。使用1 μg DNA模板時,每次反應中RNA生成量不低于50 μg。
產品組分
組分 | R0402 (3 rxns) * |
T7 RNA Polymerase Mix | 4.75 μL |
T7 Reaction Buffer | 4.75 μL |
Biotin-NTP Mix ** | 20 μL |
RNase-Free DNase I (1 U/μL) | 6.3 μL |
10× DNase Reaction Buffer | 30 μL |
RNase-Free Water | 300 μL |
*:使用20 μL體系時,本試劑盒可進行3次轉錄反應。
低溫運輸,-20℃保存,保質期12個月。
1. RNA純化回收:TRIzol LS Reagent、磁珠或過柱純化試劑盒。
2. RNA檢測:微量分光光度計、Qubit熒光計、瓊脂糖凝膠電泳設備或Agilent 2100等。
3. 其他試劑與耗材:RNase-Free或DEPC處理的PCR管和吸頭等。
使用含有T7啟動子序列的線性化質粒、PCR產物或合成的寡核苷酸為模板,模板應保證高純度高質量,避免RNase、蛋白質、RNA或鹽類污染。
以線性化質粒為模板的,應使質粒線性化形成平末端或5’突出末端,線性化后應進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,確保線性化切割完全,并純化回收。在20 μL反應體系中,線性化質粒模板可使用0.5~1 μg。
以PCR產物為模板的,可在引物上加入T7啟動子序列進行PCR擴增,確保T7啟動子序列的方向正確。PCR產物應進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,確保條帶單一且大小正確,并純化回收。在20 μL反應體系中,PCR產物模板可使用0.2~0.75 μg。
2. RNA轉錄合成
1) 從試劑盒中取出各組分試劑,冰上融化顛倒混勻,短暫離心后置于冰盒上備用。
2) 按照下表依次添加試劑,配置反應體系。
表1 RNA轉錄合成的反應體系
組分 | 用量 |
RNase-Free Water | Up to 20 μL |
T7 Reaction Buffer | 1.5 μL |
Biotin-NTP Mix | 6.5 μL |
DNA模板 | X μL (線性化質粒0.5~1 μg,PCR產物0.2~0.75 μg) |
T7 RNA Polymerase Mix | 1.5 μL |
3) 顛倒混勻并短暫離心,置于PCR儀上37℃孵育2 h。合成小于300 nt的短鏈RNA時應37℃孵育4~16 h。
3. DNA模板去除
向反應液中依次添加68 μL RNase-Free Water,10 μL 10× DNase Reaction Buffer,和2 μL RNase-Free DNase I (1 U/μL),置于PCR儀上37℃孵育15 min。
4.純化回收
使用TRIzol LS Reagent、磁珠或RNA柱純化試劑盒,純化回收生物素標記的RNA。
5.RNA檢測
1) 定量檢測
使用微量分光光度計(如Nanodrop)或Qubit熒光計檢測RNA的濃度和純度。
2) 電泳檢測
使用瓊脂糖凝膠電泳或Agilent 2100檢測RNA的大小和完整性,生物素標記的RNA分子量增大,條帶大小可能比預期偏大。使用非變性瓊脂糖凝膠電泳時,可以先將RNA置于65℃孵育10 min,再上樣檢測。