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      標題摘要內容
      高通量測序
      重磅上線 | circRNA全長鑒定及定量新策略
      來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2021-07-02 | 4691 次瀏覽 | 分享到:

      引言

      目前,circRNA的研究主要是基于二代測序平臺。雖然二代測序可以同時對數百萬個短序列讀長進行測序,但是無法完整的捕獲circRNA全長以及難以準確地對circRNA進行定量。隨著circRNA研究的不斷深入,circRNA全長序列的鑒定和分析變得越來越重要。但如何才能分析和得到circRNA的全長序列呢?有沒有新的策略能直接實現這個目標?

       

      答案是肯定的?!熬由钱愐?,善假于物也?!边@句話也很適合于納米孔測序技術。憑借其長讀長的優勢(就怕你不夠長)完爆二代測序短讀長的特點。吉賽生物最新推出的circRNA測序服務——基于納米孔測序circRNA全長鑒定和定量,就是此“物”,旨在探尋“君子”之芳容。

       

      如何探尋?

      利用隨機引物對富集后的circRNA進行滾環反轉錄擴增,使用納米孔測序技術circRNA的全長序列進行直接測序,并通過特定算法實現circRNA 表達定量和變異轉錄本全長序列的識別。

       

       

      實驗室原理圖

       

      生信分析內容及流程圖

       

       

      “芳容”如何?

      1.測序文庫大小

      我們都知道,測序文庫的大小在某種程度上會對 circRNA 分子的檢出率以及定量造成影響,因此可通過特定算法的校正,選擇最佳的檢測長度,從而使circRNA分子的檢出率達到最佳,完整捕獲circRNA分子,無須像二代測序那樣用算法去拼接。

       

      圖1. 納米孔測序文庫長度與數據量直方圖

       

      2、circRNA檢出率

       

       

      圖2. Nanopore與Illumina測序 circRNA 豐度比較。多物種以及多種生理狀態顯示,Nanopore的 circRNA 有效檢出率遠高于Illumina測序。


      3、可變剪切事件

       

      3. Nanopore 全長鑒定 circRNA 隱藏且復雜的轉錄及可變剪切圖譜



       

      4. mmu-circMsrb3_0004 在小鼠心臟/腦中的表達水平

       

       

      小鼠基因 Msrb3 只包含 3 個線性轉錄本,卻能夠轉錄至少 10 個環狀轉錄本分子(如圖3)。

      Nanopore 全長技術鑒定出的 circRNAs 多種多樣,包括

      exonic circRNAs

      EIciRNAs

      intronic circRNAs

      相比 Illumina 僅僅檢測 BSJ,Nanopore 全長鑒定能夠觀察到 circRNA 真實的內部構造,甚至發現新的 circRNA 外顯子(如圖3中紅色框)。

      特別地, Nanopore 以及 NGS 都檢測到 mmu-circMsrb3_0004 在小鼠心臟/腦中有較高的表達(如圖4),Nanopore 全長鑒定更是識別到該環狀分子的 3 isoforms。

       

       

      4、GO/Pathway富集分析Nanopore sequencing)

      a

       

       

      b

       

       

      c

       

      圖5. 癌癥/癌旁差異分析及功能富集分析表明差異circRNA 參與神經相關功能與通路

       

       

      欣賞circRNA的 “芳容”,我們可以發現納米孔測序技術在檢測circRNA上的優勢:


      更強的檢出率

      相比二代測序,納米孔測序可以將circRNA reads檢測效率提高20倍以上


      更高靈敏度

      可識別低豐度的circRNA,能夠更敏感地捕獲到非經典circRNA,i.e. intronic


      準確識別變剪切事件(特有)

      納米孔測序能夠完整地捕獲RNA分子,無須拼接,可識別 circRNA 隱藏的復雜結構

       

      我們都知道,circRNA在總RNA中的比例是非常低的,并且受到組織類型與組織狀態等的影響。但是在納米孔測序技術中,我們僅需要1 μgtotal RNA起始量即可完成納米孔的建庫與測序(circRNA二代測序至少也需要2 μg的起始量)。所以納米孔測序技術在circRNA的全長鑒定和定量中是大有作為的。我們在前面的文章也有做過相關文章的解讀:

      circRNA研究新策略 | 三代測序是否能引領circRNA走向未來


      吉賽生物在基于納米孔測序的circRNA全長鑒定和定量的研究服務中已具有豐富的經驗,形成了一套完整的解決方案。歡迎大家垂詢!

       

       

       

       

       



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      高通量測序?
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